【引言】

　　志賀菌是一種主要的全球病原體，也是志賀菌病的病原體，志賀菌癥是一種腹瀉病，主要影響中低收入國家。志賀菌病的特點(diǎn)是一種復(fù)雜的、多步驟的發(fā)病機(jī)制，在此過程中，細(xì)菌利用多種入侵蛋白來操縱和入侵腸上皮。抗體，特別是針對O抗原和一些侵襲蛋白的抗體發(fā)揮保護(hù)作用，因?yàn)獒槍μ囟乖牡味扰c疾病嚴(yán)重程度呈反比;然而，抗體在發(fā)病過程中的作用仍有待闡明，尤其是志賀菌主要是一種細(xì)胞內(nèi)病原體。在缺乏相關(guān)保護(hù)的情況下，重建志賀菌發(fā)病機(jī)制的功能測定可以提高我們對保護(hù)性抗體在阻斷感染和疾病中的作用的理解。體外檢測是建立保護(hù)相關(guān)性的重要工具。直到最近才建立了概括人類發(fā)病機(jī)制的動(dòng)物模型，但往往不是完整的。這篇綜述的目的是討論在多步驟和多階段志賀菌感染過程中評(píng)估多克隆血清中抗志賀菌抗體功能的體外試驗(yàn)。單獨(dú)測量抗體水平可能會(huì)限制對疫苗全部潛力的評(píng)估。血清殺菌測定法(SBA)和其他功能測定法，如視單吞噬細(xì)胞殺傷測定法(OPKA)和粘附/侵襲抑制測定法(AIA)，在生理上是相關(guān)的，并且可以提供關(guān)于這些效應(yīng)機(jī)制在保護(hù)性免疫中所起作用的重要信息。最終，該綜述旨在為該領(lǐng)域的科學(xué)家提供關(guān)于所選擇的功能測定的重要性的新觀點(diǎn)，該功能測定可能更能代表免疫介導(dǎo)的保護(hù)機(jī)制。

【介紹】

　　志賀菌病是一種由結(jié)腸上皮細(xì)菌感染引起的腹瀉病，其發(fā)病率和死亡率極高，全球每年死亡人數(shù)超過20萬人，尤其是在非洲和亞洲。5歲以下的兒童，特別是沒有母乳喂養(yǎng)和營養(yǎng)不良的兒童，以及70歲以上的成年人，患嚴(yán)重疾病和死亡的風(fēng)險(xiǎn)更高。志賀菌屬據(jù)報(bào)道對人類具有高度入侵性，人類是志賀菌唯一的天然宿主;事實(shí)上，攝入幾十個(gè)細(xì)菌就足以引起疾病。傳播通常通過接觸受感染的糞便、人與人之間的接觸、攝入受污染的食物和水以及接觸受污染的污染物通過糞口途徑發(fā)生。在過去的幾十年里，性接觸已成為高收入國家?guī)状我咔楸┌l(fā)的重要感染傳播途徑。典型的治療方法是使用一線和二線抗生素周期，抗微生物耐藥性急劇上升。

　　志賀菌病的病原體是四種革蘭氏陰性志賀菌，即福氏志賀菌、宋尼志賀桿菌、痢疾桿菌和博伊氏志賀桿菌，通常根據(jù)O抗原(OAg)的結(jié)構(gòu)(LPS的多糖部分)分為血清型。志賀菌與大腸桿菌具有廣泛的基因組相關(guān)性。在進(jìn)化過程中，志賀氏菌通過額外的入侵質(zhì)粒獲得必要的毒力基因，編碼增強(qiáng)其入侵能力的因子。其中，三型分泌系統(tǒng)(T3SS)的結(jié)構(gòu)成分、調(diào)節(jié)因子和效應(yīng)物對宿主感染至關(guān)重要，產(chǎn)生介導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入的針狀結(jié)構(gòu)。

　　現(xiàn)有的血清流行病學(xué)研究表明，福氏志賀菌和宋尼志賀菌是最流行的物種，根據(jù)最新的可用數(shù)據(jù)，僅福氏志賀菌五種血清型(2a、6、3a、2b和1b)就造成了中低收入國家一半以上的感染。這些病例加上宋尼氏痢疾桿菌可能占全球志賀菌病例的絕大多數(shù)。無論如何，目前的數(shù)字可能被低估了，迫切需要進(jìn)行研究，尤其是按地區(qū)區(qū)分志賀菌病的重要全球負(fù)擔(dān)，加上抗生素耐藥性志賀菌的出現(xiàn)，促使迫切需要制定新的預(yù)防和治療措施。世界衛(wèi)生組織免疫、疫苗和生物制品部門已將志賀菌疫苗的發(fā)現(xiàn)列為優(yōu)先事項(xiàng)，其理由是接種疫苗可降低志賀菌病的發(fā)病率和死亡率，以及使用抗生素誘導(dǎo)抗微生物耐藥性(AMR)。盡管付出了長期的努力，但目前還沒有獲得許可的志賀菌病疫苗，候選疫苗僅對單一血清型具有部分保護(hù)作用

【志賀菌病的發(fā)病機(jī)制】

　　志賀菌感染結(jié)腸上皮，導(dǎo)致粘膜潰瘍，并通過募集炎癥細(xì)胞引起急性炎癥。志賀菌病的分子發(fā)病機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的多步驟過程，至今尚未完全闡明。志賀菌對胃腸道的極端條件具有很強(qiáng)的耐受性，并整合了一系列環(huán)境線索，如膽汁，以提高其存活率并啟動(dòng)其侵襲表型。為了完成其感染周期并在環(huán)境中傳播，志賀菌需要進(jìn)入結(jié)腸水平的細(xì)胞內(nèi)隔室。志賀菌的主要進(jìn)入途徑是在微折疊細(xì)胞(M細(xì)胞)中確定的，微折疊細(xì)胞是一種專門的細(xì)胞，其組成性地將物質(zhì)從腸腔轉(zhuǎn)移到基底外側(cè)，由下面的有組織的腸道相關(guān)淋巴組織進(jìn)行采樣。到達(dá)上皮下隔室的志賀菌逃脫巨噬細(xì)胞吞噬作用，并與上皮的基底外側(cè)表面相互作用，觸發(fā)其再攝取。志賀菌直接入侵腸上皮細(xì)胞的想法傳統(tǒng)上被忽視，因?yàn)橹举R菌在體外和體內(nèi)模型中感染上皮的效率都不高。然而，最近一項(xiàng)使用腸芯片模型的研究表明，低細(xì)菌劑量可以顯著感染頂端的上皮細(xì)胞，該模型模擬了人體腸道中發(fā)現(xiàn)的剪切應(yīng)力和蠕動(dòng)的機(jī)械力。這些發(fā)現(xiàn)挑戰(zhàn)了M細(xì)胞是志賀菌唯一進(jìn)入點(diǎn)的觀點(diǎn)，并表明目前的上皮模型可能過于簡單化，不具有代表性。

　　據(jù)報(bào)道，志賀菌的粘附受環(huán)境條件的調(diào)節(jié)，如膽汁鹽的存在，在研究過程中需要在體外模型中復(fù)制膽汁鹽。此外，已經(jīng)描述了經(jīng)典的和新的粘附素的作用，如IcsA、MaM和T3SS分泌的OspE1/OspE2蛋白，但它們粘附的調(diào)節(jié)是T3SS依賴性的，并且它們的缺失并不能完全消除對細(xì)胞的粘附。有人提出，志賀菌可以通過結(jié)合腸粘膜中存在的宿主分子來介導(dǎo)與上皮的連接，如宿主防御肽人腸道α-防御素(HED5)，從而增強(qiáng)其粘附性。有趣的是，這一假設(shè)可以部分解釋志賀菌人類宿主的特異性。志賀菌附著在結(jié)腸上皮上所需的粘附素可能是疫苗開發(fā)的理想靶點(diǎn)，但到目前為止，這些靶點(diǎn)還沒有作為疫苗在臨床上進(jìn)行過測試。

　　進(jìn)入細(xì)胞后，志賀菌逃離內(nèi)體并擴(kuò)散到鄰近的上皮細(xì)胞，最大限度地減少暴露于細(xì)胞外環(huán)境和免疫細(xì)胞。在胞漿期，志賀菌通過外膜蛋白IcsA(或VirG)介導(dǎo)的基于動(dòng)作的運(yùn)動(dòng)機(jī)制復(fù)制并傳播到鄰近的上皮細(xì)胞。簡言之，志賀菌控制宿主的細(xì)胞骨架，在一個(gè)極點(diǎn)聚合肌動(dòng)蛋白絲來推動(dòng)自己。對細(xì)胞膜的推動(dòng)形成了向外的偽足，其中包含延伸到鄰近細(xì)胞的細(xì)菌。受體細(xì)胞最終吞噬雙膜隔室，并在胞質(zhì)溶膠中釋放細(xì)菌。

　　LPS介導(dǎo)免疫逃避，因?yàn)樗Ｗo(hù)細(xì)菌免受細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)因素的影響，如胃環(huán)境的極端酸性，并通過減少調(diào)理作用來保護(hù)細(xì)菌免受補(bǔ)體介導(dǎo)的殺傷和吞噬作用。通過改變LPS的長度和結(jié)構(gòu)，志賀菌調(diào)節(jié)對表面蛋白的可及性，從而調(diào)節(jié)免疫傳感。LPS作為細(xì)菌發(fā)病機(jī)制調(diào)節(jié)劑的作用在S.sonney中得到了進(jìn)一步擴(kuò)展，它產(chǎn)生了一種結(jié)構(gòu)類似于LPS OAg的多糖膠囊。發(fā)現(xiàn)該莢膜的存在通過掩蓋入侵的相關(guān)關(guān)鍵毒力蛋白，例如IpaB，大大降低了宋內(nèi)志賀菌入侵HeLa細(xì)胞的能力。另一方面，莢膜增加了對補(bǔ)體介導(dǎo)的殺傷的抵抗力和在兔子模型中傳播的能力。LPS在入侵過程中是否具有特定作用尚不完全清楚。體外模型研究表明，LPS可能不是細(xì)胞進(jìn)入所必需的，因?yàn)樗文问暇透Ｊ暇?Delta;OAg菌株通常用于入侵HeLa和其他細(xì)胞類型。對極化上皮的研究表明，LPS可以通過基底外側(cè)膜增強(qiáng)粘附和侵襲。這與缺乏OAg的突變體的毒性低于野生型突變體的觀察結(jié)果一致，如角結(jié)膜炎的豚鼠模型所示?？偟膩碚f，對志賀菌的自然獲得保護(hù)是血清型特異性的，這一事實(shí)證明了LPS作為志賀菌適應(yīng)因素的基本作用。

　　流行病學(xué)研究支持使用基于抗體的志賀菌生物制劑，表明生活在志賀菌流行國家的成人和兒童的自然免疫力可以預(yù)防疾病或降低嚴(yán)重程度。胎盤轉(zhuǎn)移的IgG在嬰兒出生的頭幾個(gè)月保護(hù)嬰兒免受感染。母乳中針對毒力質(zhì)粒相關(guān)抗原的高水平志賀菌特異性分泌型IgA(sIgA)可提供部分保護(hù)，甚至可預(yù)測志賀菌感染嬰兒的癥狀狀態(tài)。在兔回腸環(huán)感染模型中研究了其擬議的作用機(jī)制，并將其歸因于抗體減少結(jié)腸上皮侵襲(免疫排斥)的能力和對有害炎癥反應(yīng)的下調(diào)。

　　LPS是志賀菌最豐富的表面抗原，在流行病學(xué)和臨床研究中已被確定為潛在的保護(hù)性抗原。已有證據(jù)表明，針對志賀菌LPS的血清IgG抗體可能是保護(hù)作用的機(jī)制免疫相關(guān)性。最近，對以色列1-4歲成人和兒童宋內(nèi)志賀菌糖綴合物兩項(xiàng)試驗(yàn)的血清學(xué)和疫苗效力數(shù)據(jù)的重新分析證實(shí)了抗宋內(nèi)志賀菌之間的相關(guān)性。具有疫苗效力的宋內(nèi)志賀菌LPS抗體。

　　候選亞單位疫苗中基于向免疫系統(tǒng)顯示OAg的不同技術(shù)，從經(jīng)典的綴合物到與載體蛋白TT綴合的合成碳水化合物，與銅綠假單胞菌(rEPA)的重組外毒素A生物偶聯(lián)，與從轉(zhuǎn)基因志賀菌純化的外膜囊泡代表的遞送系統(tǒng)生物偶聯(lián)。不幸的是，由于志賀菌OAg的高變性，需要來自不同血清型的OAg的組合來誘導(dǎo)對志賀菌病的廣泛保護(hù)，盡管福氏菌OAg之間存在一定水平的交叉反應(yīng)性，這可能導(dǎo)致交叉保護(hù)。針對志賀菌蛋白的抗體，包括毒力因子如Ipa，也存在于感染受試者的血清中。與高變LPS相比，蛋白質(zhì)抗原在志賀菌屬中表現(xiàn)出更保守的優(yōu)勢。在嬰兒和自然感染者的臍帶血中發(fā)現(xiàn)了高抗T3SS蛋白滴度，表明其具有保護(hù)作用。已經(jīng)嘗試了靶向志賀菌蛋白的疫苗方法，例如針對外膜蛋白酶IcsP，然而在目前臨床開發(fā)的疫苗中，蛋白質(zhì)抗原與LPS結(jié)合。

【志賀氏菌血清學(xué)檢測】

　　血清學(xué)通常測定來量化抗原特異性抗體水平及其功能，來分離針對志賀菌的系統(tǒng)體液反應(yīng)。除了抗體的定量，功能測定是血清學(xué)方法，能夠在體外測量抗體中和或抑制志賀氏菌致病性的關(guān)鍵效應(yīng)功能的能力。粘膜體液反應(yīng)的分離不在本綜述的范圍內(nèi)，盡管如此，下面描述的一些血清學(xué)測定可以應(yīng)用于胃腸道分泌物，如糞便或直腸拭子，以提供有關(guān)粘膜抗體的信息。

　　最廣泛使用的測定抗體與單一抗原結(jié)合的特異性并量化其在血清或其他樣品中的豐度的測定法是酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)。簡言之，將抗原包被的板與感興趣的血清孵育，并且通過與酶綴合的針對第一抗體的宿主物種的第二抗體的結(jié)合來揭示抗體結(jié)合，以用感興趣的底物擴(kuò)增信號(hào)。ELISA非常簡單，可以自動(dòng)化以提高產(chǎn)量和操作員獨(dú)立性，并且可以很容易地轉(zhuǎn)移到不同的實(shí)驗(yàn)室，包括那些技術(shù)水平較低的實(shí)驗(yàn)室。流式細(xì)胞術(shù)通常用于評(píng)估血清與整個(gè)志賀菌的結(jié)合，而不是單個(gè)抗原。

　　多重技術(shù)提供了同時(shí)詢問多達(dá)數(shù)十種抗原的額外選擇，使操作員能夠并行研究血清對幾種抗原的數(shù)量、特異性和交叉反應(yīng)性。就產(chǎn)量而言，ELISA和Luminex測定可以以384孔板的形式開發(fā)，從而在進(jìn)行測定所需的樣品量較低的情況下獲得高通量?？紤]到志賀菌OAg類型的數(shù)量很高，多重免疫測定提供了最方便和節(jié)省樣本的方法來篩查自然感染和接種疫苗的個(gè)體中的多種OAg。已經(jīng)發(fā)表了含有IpaB、IpaC、IpaD和來自宋尼鏈球菌、福氏鏈球菌和痢疾桿菌的純化LPS的6倍組，其中Luminex滴度被證實(shí)與ELISA相關(guān)。

　　與天然抗原相比，抗原表達(dá)/提取、純化和用于包被或偶聯(lián)目的的修飾不可避免地會(huì)帶來變化。在志賀菌病發(fā)病機(jī)制中重要的不同關(guān)鍵抗原中，選擇細(xì)菌用熱苯酚提取純化的LPS作為免疫測定中的一致包被抗原，以測定針對不同血清型志賀菌的抗體滴度額外的分析可以更好地確定抗體的類/亞類特征和親和力。在抗體是復(fù)雜分子的情況下，功能性來自Fab相關(guān)屬性以及Fc介導(dǎo)的效應(yīng)器功能的貢獻(xiàn)。因此，功能測定應(yīng)與旨在表征和剖析免疫反應(yīng)的上述相關(guān)屬性的測定相結(jié)合。抗體亞類尤其可以至少部分預(yù)測抗體功能，因?yàn)樾?yīng)器功能在免疫復(fù)合抗體的尾部區(qū)域水平上受到蛋白質(zhì)差異和糖基化的調(diào)節(jié)。該領(lǐng)域的專家一致認(rèn)為，體液反應(yīng)值得通過使用功能測定法進(jìn)行更深入的表征，通常是血清殺菌測定法(SBA)或視單吞噬細(xì)胞殺傷測定法(OPKA)。

【志賀氏菌病的功能測定】

　　為了在臨床前水平上評(píng)估主動(dòng)和/或被動(dòng)免疫后疫苗制劑誘導(dǎo)的保護(hù)作用，經(jīng)常使用動(dòng)物的激發(fā)模型。由于志賀菌是一種人類限制性病原體，目前為評(píng)估候選疫苗的潛在保護(hù)效力而開發(fā)的動(dòng)物感染模型并不能很好地反映人類感染。所提出的小動(dòng)物挑戰(zhàn)包括豚鼠模型(直腸內(nèi)途徑)、豚鼠、兔子或小鼠的角結(jié)膜炎(Sereni試驗(yàn))、兔結(jié)扎回腸環(huán)模型、小鼠肺模型(鼻內(nèi)途徑)，和小鼠腹膜模型。R.Guerrant小組開發(fā)了一種小鼠腹瀉模型，該模型允許口服細(xì)菌，但每只小鼠接種108個(gè)細(xì)菌。最后，Mitchell及其同事在NAIP–NLRC4炎癥小體缺陷小鼠中開發(fā)了一種對志賀菌病敏感的口服感染小鼠模型，然而，只有在通過鏈霉素治療清除微生物菌群之前才可能感染，這可能會(huì)改變?nèi)肭诌^程的第一步。最終，通過控制人類感染模型(CHIM)在人體中測試候選志賀菌疫苗似乎是評(píng)估其療效的最有價(jià)值的方法。然而，在LMIC中，CHIM通常在天真的成年受試者身上進(jìn)行，而不是在嬰兒身上，因此他們的免疫反應(yīng)可能不能代表目標(biāo)人群。在確定保護(hù)性免疫反應(yīng)后，不僅從質(zhì)量上，而且必須從功能上對其進(jìn)行分析，以確定保護(hù)的替代物。這種評(píng)估必須依賴于功能測定。

　　評(píng)估抗體功能的體外測定是更好地表征引發(fā)的體液反應(yīng)特征的關(guān)鍵，有助于疫苗的開發(fā)。與評(píng)估抗體量或簡單地與細(xì)菌結(jié)合(如流式細(xì)胞術(shù))的方法相反，功能測定模擬宿主免疫反應(yīng)對抗感染機(jī)制的能力。事實(shí)上，抗體的不同效應(yīng)器功能可能在宿主的特定小生境或感染生命周期的某些步驟中發(fā)揮作用，病原體可以調(diào)節(jié)抗原的表達(dá)，以此作為感染機(jī)制，進(jìn)而逃避宿主反應(yīng)。

　　功能測定也可以旨在測量抗體介導(dǎo)的免疫效應(yīng)器功能，例如吞噬細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)菌殺傷或補(bǔ)體介導(dǎo)的裂解。Bernshtein等人對志賀菌CHIMs或臨床試驗(yàn)中這些功能測定結(jié)果與有利臨床結(jié)果之間的相關(guān)性進(jìn)行了廣泛審查。在這里，我們概述了志賀菌疫苗開發(fā)中使用的功能測定。為了便于閱讀，在圖1中，我們報(bào)告了下面描述的每一組主要功能測定的簡化方案：血清殺菌測定(SBA)、視蛋白吞噬細(xì)胞殺傷測定(OPKA)和粘附/侵襲抑制測定(AIA)。在圖2中，我們表示了每個(gè)功能測定的生理相關(guān)性。

　　圖1分析志賀氏菌抗體反應(yīng)的三種主要功能分析方法：SBA、OPKA、AIA

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　　圖2 主要的功能分析，以評(píng)估體液反應(yīng)對抗志賀氏菌病的發(fā)病步驟

【血清殺菌試驗(yàn)】

　　血清殺菌試驗(yàn)(SBA)通過測量補(bǔ)體介導(dǎo)的革蘭氏陰性菌(如志賀菌)的裂解來評(píng)估調(diào)理抗體的功能。結(jié)合細(xì)菌表面的相關(guān)亞類抗體激發(fā)補(bǔ)體激活的經(jīng)典和替代途徑，沉積補(bǔ)體元素，最終形成裂解孔(BOX1)。SBA是疫苗開發(fā)人員用于測量抗革蘭氏陰性菌抗體功能的最廣泛的功能測定法。事實(shí)上，SBA通常用于分析針對志賀菌的體液反應(yīng)。無論是來自自然暴露的個(gè)體、挑戰(zhàn)患者還是接種疫苗的患者。在幾項(xiàng)研究中，高SBA滴度與對中度至重度疾病的一定程度的保護(hù)有關(guān)，這表明SBA可能是保護(hù)的功能相關(guān)性，概括了抗體在志賀菌發(fā)病機(jī)制中的積極作用。殺菌活性主要?dú)w因于抗LPS/OAg抗體，可能是因?yàn)長PS提供了豐富和重復(fù)的表面抗原，有利于抗體的六聚化，從而有利于補(bǔ)體沉積。

　　殺菌活性本身在志賀菌病發(fā)病機(jī)制中的作用仍有待闡明，因?yàn)楦腥就ǔ＞窒抻诮Y(jié)腸粘膜，腸外并發(fā)癥很少。細(xì)菌裂解只能發(fā)生在細(xì)胞外基質(zhì)相對富含補(bǔ)體和血清抗體的上皮下方。因此，SBA滴度可以提供一個(gè)有用的指示，說明保護(hù)性抗體如何增強(qiáng)志賀菌補(bǔ)體的敏感性和防止基底外側(cè)再次感染的能力。腸腔也可能是補(bǔ)體介導(dǎo)的裂解的忽略設(shè)置，因?yàn)樵谀c表面發(fā)現(xiàn)了IgM和IgG以及至少一部分補(bǔ)體元素。SBA滴度如何在這方面反映粘膜免疫是一個(gè)有待研究的問題。

　　檢測方案認(rèn)為，細(xì)菌與調(diào)理抗體源以及外源性補(bǔ)體源一起孵育，最常見的是幼兔補(bǔ)體(BRC)(圖1)。待測抗體激活補(bǔ)體，導(dǎo)致細(xì)菌裂解。測定的結(jié)果通常表示為50%的抑制濃度(IC50)，其指示與陰性對照相比殺死一半總細(xì)菌所需的抗體或血清的濃度。已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了對經(jīng)典測定的幾項(xiàng)改進(jìn)，主要旨在縮短測定的持續(xù)時(shí)間并提高其產(chǎn)量，包括將測定小型化為384孔形式，以及與平板和計(jì)數(shù)存活菌落形成單位(CFU)相比，可簡化讀數(shù)?；诒壬l(fā)光和/或熒光讀數(shù)的替代方法已將SBA轉(zhuǎn)換為一天測定。這些讀數(shù)通常來源于活細(xì)菌與代謝試劑的反應(yīng)。Necchi等人開發(fā)了一種基于發(fā)光的SBA(L-SBA)方案，該方案可檢測活細(xì)菌產(chǎn)生的ATP，并且該方法已得到優(yōu)化和表征，以分析來自多項(xiàng)研究的臨床樣本。Resazurin提供了一種替代的比色和熒光終點(diǎn)。該測定的局限性包括需要根據(jù)其固有的補(bǔ)體敏感性，即通過自發(fā)補(bǔ)體激活裂解多少細(xì)菌，對所使用的每種志賀菌菌株調(diào)整測定條件。

【吞噬細(xì)胞和殺傷試驗(yàn)（OPA/OPK）】

　　調(diào)理吞噬細(xì)胞測定法(OPA)和調(diào)理吞噬細(xì)胞殺傷測定法(OPKA)測量抗體介導(dǎo)吞噬細(xì)胞內(nèi)化和/或殺傷志賀菌的能力。志賀菌的吞噬試驗(yàn)不僅提供了一種測量抗體與效應(yīng)免疫細(xì)胞結(jié)合能力的方法，而且可以為該疾病的發(fā)病機(jī)制提供線索。在感染過程中，志賀菌與位于派爾貼片下的上皮下巨噬細(xì)胞和募集的多形核細(xì)胞(PMN)相互作用。這兩種細(xì)胞類型都通過吞噬受體——Fcγ受體(FcγR)和補(bǔ)體受體(CR1和CR3)——感知調(diào)理細(xì)菌，并最終吞噬和清除病原體。然而，吞噬作用可能是一把雙刃劍，因?yàn)橥淌杉?xì)胞放大的過度炎癥可能會(huì)對宿主產(chǎn)生負(fù)面影響。事實(shí)上，志賀氏菌通過釋放破壞組織的促炎細(xì)胞因子操縱誘導(dǎo)上皮下巨噬細(xì)胞焦下垂的炎癥反應(yīng)，并通過釋放有毒顆粒物使PMN壞死，從而破壞上皮屏障。此外，有人提出，被招募到固有層感染部位的PMN可以通過上皮層遷移，提供額外的進(jìn)入途徑以及破壞性的炎癥環(huán)境。PMNs募集的抑制，以及體內(nèi)相關(guān)促炎細(xì)胞因子的抑制，保持了上皮的完整性。志賀菌病發(fā)病機(jī)制的這些方面鼓勵(lì)建立和使用吞噬作用測定法，以不僅驗(yàn)證志賀菌的攝取，而且驗(yàn)證其迅速有效的清除，以及抗體的存在是否可以調(diào)節(jié)有利于清除的結(jié)果并包含附帶損傷。

　　在吞噬作用測定方案中，將吞噬細(xì)胞與調(diào)理志賀菌孵育適當(dāng)時(shí)間。然后通過多種可能的讀數(shù)評(píng)估細(xì)菌(或細(xì)菌的替代物)的內(nèi)化和/或殺死，包括菌落的CFU計(jì)數(shù)，或基于流式細(xì)胞術(shù)(圖1)。根據(jù)細(xì)胞類型和所用調(diào)理素的組合，該測定提供了不同的適應(yīng)癥。像THP-1單核細(xì)胞這樣的非分化細(xì)胞不能殺死，并且只能提供抗體介導(dǎo)的靶標(biāo)內(nèi)化的指示。相反，通過使用更特化的細(xì)胞(例如，原代中性粒細(xì)胞、分化的HL-60、分化的THP-1巨噬細(xì)胞)，可以評(píng)估血清的殺傷效率。補(bǔ)體通常被添加到測定中，以評(píng)估FcγRs-和CR介導(dǎo)的協(xié)同攝取和殺傷。

　　OPKA已經(jīng)被用于評(píng)估臨床樣本的功能。首先建立了具有分化HL-60的經(jīng)典OPKA，以評(píng)估在BRC存在的情況下用接種疫苗和激發(fā)患者的血清調(diào)理的志賀菌的殺傷作用，從而最終將功能性抗體活性和保護(hù)作用聯(lián)系起來。與相應(yīng)嬰兒的臍帶血相比，同樣的測定方法用于測量保護(hù)性母體血液誘導(dǎo)的功能反應(yīng)。OPA和OPKA都被插入功能測定的系統(tǒng)血清學(xué)小組中，不同之處在于OPKA是用原代人中性粒細(xì)胞而不是分化的HL-60進(jìn)行的。使用來自全血的THP-1單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的基于流式細(xì)胞術(shù)的OPA來評(píng)估涂有感興趣的抗原而不是整個(gè)志賀菌的珠的調(diào)理吞噬作用.有趣的是，雖然SBA和OPKA的結(jié)果通常相互關(guān)聯(lián)，并且就癥狀嚴(yán)重程度而言，用特異性抗原進(jìn)行的OPA測定提供了新的見解，與SBA和OPKA滴度相反，OAg和IpaB抗體與癥狀嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)。最后，使用經(jīng)典的OPKA來評(píng)估用候選的基于GMMA的疫苗免疫的小鼠的免疫反應(yīng)。

　　OPA和OPKA存在一些困難，其中包括補(bǔ)體和細(xì)胞條件的調(diào)節(jié)，必須對其進(jìn)行精細(xì)調(diào)整，以欣賞吞噬細(xì)胞衍生的殺傷，而不是血清殺菌測定。此外，當(dāng)使用流式細(xì)胞術(shù)或熒光顯微鏡來獲得實(shí)驗(yàn)條件以獲得每種細(xì)菌菌株的足夠熒光時(shí)，必須優(yōu)化。

【粘附/侵襲抑制試驗(yàn)】

　　入侵測定已被廣泛用于鑒定介導(dǎo)宿主-病原體相互作用的靶標(biāo)，并主要通過T3SS確定宿主細(xì)胞的入侵。IpaB被描述為與脂筏中的HeLa表面受體CD44和膽固醇相互作用，而IpaB-CD復(fù)合物與整合素α5β1結(jié)合，將細(xì)菌錨定在細(xì)胞表面，并促進(jìn)T3SS在其上形成孔。

　　粘附/侵襲抑制試驗(yàn)(AIA)用于證明抗體，特別是針對Ipa蛋白的抗體，降低毒力的能力。概括分析方案，通常以96孔板形式組織的復(fù)雜度可變的體外細(xì)胞模型感染一定數(shù)量的活細(xì)菌，這些活細(xì)菌在含有感興趣抗體的溶液中調(diào)理(圖1)。培養(yǎng)時(shí)間根據(jù)所需讀數(shù)進(jìn)行調(diào)整：幾分鐘可以更好地評(píng)估粘附性，幾小時(shí)可以更好地了解入侵。通常情況下，通過重復(fù)的洗滌步驟將多余的細(xì)菌從細(xì)胞中沖洗掉。最后，細(xì)菌的粘附/侵襲率可以通過兩種主要方法相對于非調(diào)理對照進(jìn)行評(píng)估：總細(xì)菌或內(nèi)部細(xì)菌的CFU計(jì)數(shù)(在慶大霉素處理細(xì)胞以殺死外部細(xì)菌時(shí))，或者通過免疫熒光顯微鏡，可能用復(fù)染物來區(qū)分內(nèi)部細(xì)菌和外部細(xì)菌。

　　動(dòng)物血清和抗IpaD、IpaB和IpaC的單克隆抗體被證明可以降低毒力細(xì)菌在體外細(xì)胞模型中感染的能力。這些工作與動(dòng)物模型中的研究一致，在動(dòng)物模型中，用IpaB和IpaD免疫的小鼠在攻擊時(shí)產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)(IgG和IgA)，因此在體內(nèi)證明了抗Ipa抗體的相關(guān)性。然而，Ipa蛋白的中和可能會(huì)受到一些因素的損害，如影響從胞質(zhì)溶膠轉(zhuǎn)移到細(xì)菌表面的環(huán)境線索、Ipa在尖端復(fù)合物中對抗體結(jié)合的短暫可及性。

　　此外，入侵檢測被用于評(píng)估OAg的重要性，不僅在SBA的情況下，而且在感染期間。事實(shí)上，Chowers及其同事表明，用LPS的福氏志賀菌2a或宋尼志賀菌OAg部分免疫的兒童血清抑制同源菌株對上皮細(xì)胞Caco-2的侵襲。Caboni等人還證明，宋尼S.sonney的OAg同源膠囊的存在削弱了HeLa細(xì)胞的侵襲。

　　分化上皮的更復(fù)雜模型包括Caco-2和RajiB細(xì)胞的共培養(yǎng)，以產(chǎn)生具有跨細(xì)胞M細(xì)胞的成熟腸毛囊相關(guān)上皮。該模型用于提出M細(xì)胞到腸細(xì)胞的途徑是志賀菌的主要傳播途徑，以避開基底外側(cè)隔室。使用來自原發(fā)組織的2D人類腸道類腸(HIE)作為感染模型，證實(shí)了來自M細(xì)胞和基底外側(cè)隔室的優(yōu)先感染。HIE可以與PMN共同培養(yǎng)，以研究志賀菌與PMN上皮細(xì)胞相互作用的相互作用。最后，來源于原代人類組織的3D上皮類器官可能是志賀菌感染的一個(gè)有趣的模型，特別是具有相反極性的頂端外類器官將代表另一個(gè)有用的模型，用于研究上皮頂端與基底外側(cè)的侵襲。

　　如前所述，志賀菌傳統(tǒng)上被觀察到從頂端表面侵入極化體外細(xì)胞模型的能力很低，以至于在許多實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，?xì)菌必須通過離心作用被強(qiáng)迫進(jìn)入細(xì)胞，使用表達(dá)異源蛋白以人工增強(qiáng)粘附的志賀菌突變體、AfaI粘附素，即使在存在M細(xì)胞的情況下也是如此。志賀菌在這些培養(yǎng)物中的粘附/侵襲機(jī)制是否忠實(shí)于感染的生理學(xué)是一個(gè)有爭議的問題。

　　免疫球蛋白在腸腔中的狀態(tài)仍然是確定功能性/非功能性單克隆抗體比率的基本主題。一個(gè)例子是，mAb不僅作為單個(gè)實(shí)體存在于腸腔道中，而且與分泌成分(SC)復(fù)合。SC是聚合物Ig受體的可溶性部分，負(fù)責(zé)IgG從腸道的基底外側(cè)轉(zhuǎn)移到管腔空間。當(dāng)IgG聚合物Ig受體復(fù)合物暴露在管腔中時(shí)，存在于消化道中的蛋白酶將該受體的跨膜成分從SC上裂解，SC保持附著在IgG上。SC-IgG復(fù)合物有利于IgG在腸腔道中的半衰期和IgG自身的效應(yīng)器功能。事實(shí)上，研究表明，只有在SC存在的情況下，針對福氏志賀菌的LPS特異性單克隆抗體才能對上皮細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。

【接觸溶血試驗(yàn)】

　　T3SS介導(dǎo)的膜裂解，可能通過易位誘導(dǎo)的孔形成，需要與真核細(xì)胞表面接觸。利用這一特性，Sansonetti及其同事建立了一種接觸性溶血測定法，將志賀菌與綿羊紅細(xì)胞孵育，導(dǎo)致血紅蛋白在溶液中釋放，從而為膜裂解提供比色讀數(shù)。溶血被證明是T3SS依賴性的，并且是1)溫度依賴性，因?yàn)橐阎猅3SS的表達(dá)發(fā)生在37°C而不是30°C;2) 質(zhì)粒編碼，當(dāng)檢測非侵入性志賀菌時(shí)沒有發(fā)生;3) 接觸介導(dǎo)的細(xì)菌和紅細(xì)胞之間的粘附必須通過細(xì)菌在紅細(xì)胞上的造粒來誘導(dǎo)。

　　有趣的是，Clerc等人證明志賀菌的接觸性溶血量與穿透HeLa細(xì)胞的能力相關(guān)，這表明接觸性溶血測定可能代表吞噬液泡裂解的初始步驟的時(shí)間和成本效益近似值，這是細(xì)菌在結(jié)腸上皮細(xì)胞內(nèi)增殖的關(guān)鍵步驟。

　　自1986年以來，接觸溶血試驗(yàn)在隨后的工作中再次使用，以證明毒力因子的膜破壞活性，并研究T3SS轉(zhuǎn)運(yùn)子IpaBD。到目前為止，只有Sieroki等人使用接觸性溶血作為功能測定來證明交叉反應(yīng)性抗IpaD(志賀氏菌)-SipD(沙門氏菌)單克隆抗體抑制膜裂解的能力。有趣的是，測試的抗體(mAb-IpaD-318)被發(fā)現(xiàn)可以增強(qiáng)紅細(xì)胞的溶血，但不能增強(qiáng)HeLa細(xì)胞的侵襲。作者假設(shè)mAb-IpaD-318將聚合的IpaD穩(wěn)定在中間構(gòu)象，該構(gòu)象失去了控制正確的IpaB和IpaC易位的能力。據(jù)報(bào)道，針對IpaD的抗體片段也可顯著減少野生型福氏菌的紅細(xì)胞溶血。

【系統(tǒng)血清學(xué)方法】

　　迄今為止，研究的單一抗體特異性、質(zhì)量或效應(yīng)功能似乎都不是志賀菌病保護(hù)性免疫的絕對預(yù)測因素;因此，額外的抗體功能和/或不同方面的整合有可能預(yù)測針對志賀菌的成功體液免疫。Galit Alter團(tuán)隊(duì)于2015年首次開發(fā)的系統(tǒng)血清學(xué)方法，通過一系列不同的血清學(xué)檢測詢問臨床血清樣本，然后通過機(jī)器學(xué)習(xí)和其他高維工具整合結(jié)果，以定義與各種疾病的良好患者結(jié)果相關(guān)的特異性抗體譜，包括志賀菌病。該圖譜通過功能測定和生物物理測量來詢問Fc效應(yīng)器的功能。

　　Bernshtein及其同事應(yīng)用系統(tǒng)血清學(xué)方法在CHIM中對福氏2a鏈球菌攻擊患者的血清進(jìn)行了分析。在他們的研究中，他們采用了以下高通量定量抗體測定法：通過Luminex，他們確定了與感興趣的抗原(多種LPS類型，IpaD、IpaB、IpaC、IpaH、VirG)結(jié)合的抗體的亞類或同種型(IgG1-2-3、IgA1-2、IgM)。有趣的是，F(xiàn)cγ受體與免疫復(fù)合抗原的結(jié)合被強(qiáng)烈推薦為抗體效應(yīng)器功能的可能預(yù)測因子，這一方面在血清學(xué)實(shí)驗(yàn)室中沒有常規(guī)使用。

　　對調(diào)理珠和活志賀菌進(jìn)行功能測定(補(bǔ)體沉積、SBA和OPA/OPK)。為了測量補(bǔ)體沉積，將免疫復(fù)合物與幼兔補(bǔ)體孵育，以確定抗體啟動(dòng)補(bǔ)體級(jí)聯(lián)的能力。據(jù)我們所知，這種檢測方法也沒有常規(guī)使用，尤其是在蛋白質(zhì)靶點(diǎn)上，因?yàn)榛钪举R菌上的補(bǔ)體沉積主要由抗LPS抗體驅(qū)動(dòng)。然而，這種測定可能有助于概括具有蛋白質(zhì)特異性的抗體的有用功能方面，例如揭示一些蛋白質(zhì)靶標(biāo)在更多地暴露于細(xì)菌表面時(shí)仍然可能是補(bǔ)體沉積的驅(qū)動(dòng)因素。珠上的補(bǔ)體沉積與活志賀菌上的經(jīng)典SBA相結(jié)合。

　　至少有三種主要和互補(bǔ)的功能測定被描述為吞噬作用：全血中的抗體依賴性中性粒細(xì)胞吞噬作用(ADNP)、抗體依賴性細(xì)胞(單核細(xì)胞)吞噬作用(ADC)，兩者都用免疫復(fù)合珠進(jìn)行，以及用活志賀菌進(jìn)行的經(jīng)典OPK

【結(jié)論】

　　針對人類病原體的疫苗是改善全球健康和對抗新出現(xiàn)的抗微生物耐藥性的基本工具。評(píng)估抗體生物物理特性和抗體功能的體外試驗(yàn)是識(shí)別保護(hù)性體液反應(yīng)特征的關(guān)鍵，極大地幫助了疫苗的開發(fā)。在缺乏與保護(hù)相關(guān)的抗體類別或亞類(例如IgA與IgG)的明確指示，以及與不同年齡組的臨床保護(hù)相關(guān)的關(guān)鍵和驗(yàn)證水平的情況下，證明抗體中和病原體活性并更好地殺死病原體活性的能力是關(guān)鍵。然而，功能測定是病原體特異性的，僅概括了宿主-病原體相互作用的精確步驟。從技術(shù)角度來看，功能測定需要提供足夠的產(chǎn)量，以允許以成本效益高的方式篩選多個(gè)樣品。因此，理想的功能測定平衡了生理相關(guān)性、合適的產(chǎn)量和成本效益。

　　在這篇綜述中，我們介紹了用于評(píng)估抗志賀菌抗體功能的主要功能測定法，并討論了每種測定法可以近似于志賀菌感染機(jī)制的不同階段(圖2)。SBA滴度已被證明與有效的抗體誘導(dǎo)的補(bǔ)體介導(dǎo)的殺傷相關(guān)的保護(hù)增加相關(guān)。然而，我們可以推測，SBA的價(jià)態(tài)可以延伸到細(xì)菌裂解之外，間接提供了調(diào)理對活細(xì)菌功效的一般指示，而調(diào)理是多種免疫防御機(jī)制的核心。眾所周知，SBA滴度與OPA/OPK滴度有關(guān)，因?yàn)檫@兩種機(jī)制依賴于抗體依賴性補(bǔ)體沉積，其可以通過Fcγ受體和吞噬補(bǔ)體受體CR1和CR3向吞噬細(xì)胞發(fā)信號(hào)。補(bǔ)體在細(xì)菌上的沉積也產(chǎn)生了一個(gè)重要的細(xì)胞內(nèi)防御信號(hào)，有利于細(xì)胞內(nèi)病原體的自噬和清除，SBA滴度也可以反映這一點(diǎn)。

　　志賀菌在結(jié)腸上皮中的滲透可以說是志賀菌病發(fā)病機(jī)制中被抗體抑制的最關(guān)鍵的步驟。因此，測量抗體防止體外上皮模型粘附和/或侵襲的能力的功能測定是基本工具。重要的是，粘附/侵襲測定是唯一模擬發(fā)生在腸腔水平的事件的測定，為測試抗體的粘膜亞類的重要性開辟了有趣的選擇。盡管有明顯的重要性，但到目前為止，臨床測試中還沒有進(jìn)行粘附/侵襲分析。

　　在建立這種功能測定的困難中，有一個(gè)是確定要測試的抗體的相關(guān)靶點(diǎn)。事實(shí)上，抗體的效應(yīng)器功能可能在宿主的特定生態(tài)位或感染生命周期的某些步驟中發(fā)揮作用，而病原體可以調(diào)節(jié)抗原的表達(dá)，作為感染機(jī)制，進(jìn)而逃避宿主反應(yīng)。雖然SBA主要由靶向LPS的抗體驅(qū)動(dòng)，但入侵的最初步驟(尚未完全闡明)是由T3SS介導(dǎo)的，可能與其他毒力因子結(jié)合，大大增加了待處理的可能靶點(diǎn)的復(fù)雜性，或者表明在感染過程的各個(gè)步驟期間多種抗體和機(jī)制的協(xié)同作用。

　　相關(guān)表面抗原的表達(dá)和結(jié)構(gòu)修飾可能受到環(huán)境因素的調(diào)節(jié)，如膽鹽暴露、pH、溫度、葡萄糖濃度和氧氣，這些因素被認(rèn)為是細(xì)菌在小腸和大腸之間定位的信號(hào)。在標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)菌生長/條件以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，必須考慮這些因素，脫氧膽酸鹽和氧密度與真核細(xì)胞膜的存在相結(jié)合可能是最有前景的。

　　總之，一組多功能檢測的可用性將是在臨床前和臨床環(huán)境中分離志賀菌感染或疫苗接種誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)的基礎(chǔ)，并揭示抗體在誘導(dǎo)對志賀菌病的保護(hù)中所起的作用。
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　　原文出處：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC10227456/

　　指導(dǎo)老師：王戰(zhàn)輝