1. 單克隆抗體的基本概念

　　由單一B細胞克隆產(chǎn)生的高度均一、僅針對某一特定抗原表位的抗體，稱為單克隆抗體。通常采用雜交瘤技術(shù)來制備，雜交瘤(hybridoma)抗體技術(shù)是在細胞融合技術(shù)的基礎(chǔ)上，將具有分泌特異性抗體能力的致敏B細胞和具有無限繁殖能力的骨髓瘤細胞融合為B細胞雜交瘤。用具備這種特性的單個雜交瘤細胞培養(yǎng)成細胞群，可制備針對一種抗原表位的特異性抗體即單克隆抗體。

　　圖1 抗體結(jié)構(gòu)

　　2. 單克隆抗體技術(shù)的基本原理

　　要制備單克隆抗體需先獲得能合成專一性抗體的單克隆B淋巴細胞，但這種B淋巴細胞不能在體外生長。而實驗發(fā)現(xiàn)骨髓瘤細胞可在體外生長繁殖，應(yīng)用細胞雜交技術(shù)使骨髓瘤細胞與免疫的淋巴細胞二者合二為一，得到雜種的骨髓瘤細胞。這種雜種細胞繼承兩種親代細胞的特性，它既具有B淋巴細胞合成專一抗體的特性，也有骨髓瘤細胞能在體外培養(yǎng)增殖永存的特性，用這種來源于單個融合細胞培養(yǎng)增殖的細胞群，可制備抗一種抗原決定簇的特異單克隆抗體。其制備原理示意如下：

　　圖2 單克隆抗體制備原理示意圖

　　3. 單克隆抗體制備的基本流程

　　(1)免疫動物

　　免疫動物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠產(chǎn)生致敏B淋巴細胞的過程。一般選用6-8周齡雌性Balb/c小鼠，按照預(yù)先制定的免疫方案進行免疫注射?？乖ㄟ^血液循環(huán)或淋巴循環(huán)進入外周免疫器官，刺激相應(yīng)B淋巴細胞克隆，使其活化、增殖，并分化成為致敏B淋巴細胞。

　　(2)細胞融合

　　采用眼球摘除放血法處死小鼠，無菌操作取出脾臟，在平皿內(nèi)擠壓研磨，制備脾細胞懸液。 將準(zhǔn)備好的同系骨髓瘤細胞與小鼠脾細胞按一定比例混合，并加入促融合劑聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各種淋巴細胞可與骨髓瘤細胞發(fā)生融合，形成雜交瘤細胞。

　　(3)選擇性培養(yǎng)

　　選擇性培養(yǎng)的目的是篩選融合的雜交瘤細胞，一般采用HAT選擇性培養(yǎng)基。在HAT培養(yǎng)基中，未融合的骨髓瘤細胞因缺乏次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，不能利用補救途徑合成DNA而死亡。未融合的淋巴細胞雖具有次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，但其本身不能在體外長期存活也逐漸死亡。只有融合的雜交瘤細胞由于從脾細胞獲得了次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，并具有骨髓瘤細胞能無限增殖的特性，因此能在HAT培養(yǎng)基中存活和增殖。

　　(4)雜交瘤陽性克隆的篩選與克隆化

　　在HAT培養(yǎng)基中生長的雜交瘤細胞，只有少數(shù)是分泌預(yù)定特異性單克隆抗體的細胞，因此，必須進行篩選和克隆化。通常采用有限稀釋法進行雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng)。采用靈敏、快速、特異的免疫學(xué)方法，篩選出能產(chǎn)生所需單克隆抗體的陽性雜交瘤細胞，并進行克隆擴增。經(jīng)過全面鑒定其所分泌單克隆抗體的免疫球蛋白類型、亞類、特異性、親和力、識別抗原的表位及其分子量后，及時進行凍存。

　　圖3 單克隆抗體的制備流程

　　(5)單克隆抗體的大量制備

　　單克隆抗體的大量制備主要采用動物體內(nèi)誘生法和體外培養(yǎng)法：

　　①體內(nèi)誘生法 取Balb/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液體石臘或降植烷進行預(yù)處理。1-2周后，腹腔內(nèi)接種雜交瘤細胞。雜交瘤細胞在小鼠腹腔內(nèi)增殖，并產(chǎn)生和分泌單克隆抗體。約1-2周，可見小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可獲得大量單克隆抗體。

　?、隗w外培養(yǎng)法 將雜交瘤細胞置于培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，雜交瘤細胞產(chǎn)生并分泌單克隆抗體，收集培養(yǎng)上清液，離心去除細胞及其碎片，即可獲得所需要的單克隆抗體。但這種方法產(chǎn)生的抗體量有限。近年來，各種新型培養(yǎng)技術(shù)和裝置不斷出現(xiàn)，大大提高了抗體的生產(chǎn)量。雜交瘤細胞融合后，要進行篩選后才能使用。雜交瘤細胞分為兩次：一次是篩選出雜交瘤細胞;另一次是在初選的雜交瘤細胞中篩選出能產(chǎn)生特異性抗體的雜家瘤細胞，這兩次篩選的方法和原理各不相同。

　　4. 單克隆抗體制備的應(yīng)用

　　單克隆抗體的制備可應(yīng)用于以下各種生命科學(xué)實驗并具有醫(yī)用價值：

　　(1)凝集實驗：haemaglutination

　　(2)沉淀反應(yīng)：Precipitation reaction

　　(3)ELISA 等免疫學(xué)檢測

　　(4)親和層析：分離蛋白質(zhì)

　　(5)免疫印記(western blotting)

　　(6)免疫沉淀

　　(7)BIAcore biosensor:檢測Ab-Ag或與蛋白的親和力

　　(8)放射免疫學(xué)方法檢測免疫復(fù)合物

　　(9)磁珠分離細胞

　　(10)流式細胞儀：用于細胞的分型和細胞分離

　　(11)臨床疾病的診斷和治療