單克隆抗體制備流程
發(fā)布時間：2020-08-17 00:12:22來源：抗體知識專題
免疫動物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠產(chǎn)生致敏B淋巴細胞的過程。 一般選用6-8周齡雌性Balb/c小鼠，按照預(yù)先制定的免疫方案進行免疫注射。
2.細胞融合處死小鼠，無菌操作取出脾臟，在平皿內(nèi)擠壓研磨，通過細胞分離網(wǎng)制備B淋巴細胞懸液。將準(zhǔn)備好的同系骨髓瘤細胞與小鼠脾細胞按一定比例混合，并加入促融合劑聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各種淋巴細胞可與骨髓瘤細胞發(fā)生融合，形成雜交瘤細胞。
3.選擇性培養(yǎng)選擇性培養(yǎng)的目的是篩選融合雜交瘤細胞，一般采用HAT選擇性培養(yǎng)基。在HAT培養(yǎng)基中，未融合的骨髓瘤細胞因缺乏次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，不能利用補救途徑合成DNA而死亡。 未融合的淋巴細胞雖具有次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，但其本身不能在體外長期存活也逐漸死亡。 只有融合的雜交瘤細胞由于從脾細胞獲得了次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，并具有骨髓瘤細胞能無限增殖的特性，因此能在HAT培養(yǎng)基中存活和增殖。
4.雜交瘤陽性克隆的篩選與克隆化在HAT培養(yǎng)基中生長的雜交瘤細胞，只有少數(shù)是分泌預(yù)定特異性單克隆抗體的細胞，因此，必須進行篩選和克隆化。通常采用有限稀釋法進行雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng)。采用靈敏、快速、特異的免疫學(xué)方法，篩選出能產(chǎn)生所需單克隆抗體的陽性雜交瘤細胞，并進行克隆擴增。經(jīng)過全面鑒定其所分泌單克隆抗體的免疫球蛋白類型、亞類、特異性、親和力、識別抗原的表位及其分子量后，及時進行凍存。
5.單克隆抗體的大量制備單克隆抗體的大量制備重要采用動物體內(nèi)誘生法和體外培養(yǎng)法。