免疫層析法看似簡(jiǎn)單，其實(shí)里面還有很多沒(méi)有解決的問(wèn)題。能夠搞明白其中的一些科學(xué)問(wèn)題，或者做出一些有價(jià)值的實(shí)際應(yīng)用出來(lái)，一定是我們快檢人的目標(biāo)了。作為剛?cè)胄锌鞕z一年的小萌新，在下面羅列了關(guān)于免疫層析的一些問(wèn)題和個(gè)人的理解，希望大家在評(píng)論區(qū)一起思考和討論吧。

　　抗體制備

　　1 、用什么與半抗原偶聯(lián)合適，為了增強(qiáng)半抗原的免疫原性，通常使用BSA和KLH，可以考慮其它蛋白質(zhì)類(lèi)載體，或者利用多糖類(lèi)載體，與佐劑配合使用增強(qiáng)免疫效果。

　　2 、如何通過(guò)原藥設(shè)計(jì)半抗原，產(chǎn)生的抗體一定源于希望的識(shí)別位點(diǎn)嗎?碳鏈長(zhǎng)度多少合適?太長(zhǎng)可能折疊，太短可能被蛋白遮蔽，文獻(xiàn)顯示6-8個(gè)碳鏈比較合適。

　　3 、對(duì)于免疫佐劑的使用，為了增強(qiáng)免疫效果，通常使用弗式佐劑，但是乳化過(guò)程十分劇烈，對(duì)于不穩(wěn)定的抗原可能導(dǎo)致解離，可以考慮使用礦物鹽類(lèi)和多糖類(lèi)親水佐劑。

　　4 、通常需要四免甚至五免才有較好的抑制，周期過(guò)長(zhǎng)，能否通過(guò)增加免疫劑量或者縮短每次免疫之間的間隔，從而縮短免疫周期。

　　5、 細(xì)胞融合時(shí)，小鼠的脾臟大小差異很大，導(dǎo)致脾細(xì)胞的數(shù)量差異很大，是否可以通過(guò)調(diào)節(jié)飲食或者環(huán)境使小鼠具有更多的脾細(xì)胞?

　　6、 通常用PEG誘導(dǎo)融合，得到一定比例的雜交瘤細(xì)胞，需要用HAT培養(yǎng)基進(jìn)一步篩選，其它融合手段如電融合能否提高雜交瘤細(xì)胞的比例?

　　7、 通常采用有限稀釋法進(jìn)行亞克，篩選陽(yáng)性細(xì)胞步驟繁瑣且周期較長(zhǎng)，可以借助一些設(shè)備，如流式細(xì)胞儀等進(jìn)行篩選。

　　8 、雜交瘤細(xì)胞穩(wěn)定性較差，傳代過(guò)程中可能發(fā)生染色體丟失，導(dǎo)致亞克得到的陽(yáng)性細(xì)胞株轉(zhuǎn)陰，除了連續(xù)進(jìn)行兩到三輪亞克或者及時(shí)凍存陽(yáng)性細(xì)胞株之外，還有什么辦法可以避免轉(zhuǎn)陰?能否通過(guò)加入維持雜交瘤細(xì)胞遺傳穩(wěn)定性的物質(zhì)?

　　材料合成

　　9 、通常選擇對(duì)激發(fā)光的吸收更好和量子產(chǎn)率更高的熒光材料，從而具有更高的熒光強(qiáng)度，能夠提高免疫層析法的靈敏度，但是方法的靈敏度和材料的熒光強(qiáng)度之間有什么具體的關(guān)系?

　　10 、增強(qiáng)聚集誘導(dǎo)發(fā)光材料的共軛程度，會(huì)使材料的發(fā)射峰紅移，通常能夠降低背景干擾，這個(gè)背景一部分是基質(zhì)，比如豇豆本身具有綠色的熒光，還有哪些情況是背景干擾呢?

　　11 、光激發(fā)使材料中的電子發(fā)生躍遷，通過(guò)輻射躍遷到基態(tài)便產(chǎn)生熒光，通過(guò)非輻射躍遷到基態(tài)便產(chǎn)生光熱，所以通常熒光和光熱的雙功能都是復(fù)合材料，且熒光存在被光熱材料淬滅的風(fēng)險(xiǎn)，是否存在一種材料能夠平衡熒光和光熱的特性?

　　12 、不同材料具有不同的特性，比如金的比色和光熱，AIE和量子點(diǎn)的熒光，納米酶的催化，F(xiàn)e3O4的磁性，將這些材料復(fù)合后便具備了多重特性，復(fù)合材料的某種特性可以不需要優(yōu)于單個(gè)材料，只要優(yōu)于傳統(tǒng)材料就行。

　　抗體標(biāo)記

　　13 、看似簡(jiǎn)單的抗體標(biāo)記過(guò)程，其實(shí)有很多的講究和方法，有的材料可以通過(guò)靜電吸附標(biāo)記，有的帶羧基的材料可以通過(guò)EDC法標(biāo)記，有的材料需要包覆一層物質(zhì)輔助標(biāo)記，如PDA和MPN。

　　14、 不同標(biāo)記方法影響很大，如何確定最適合于材料的標(biāo)記方法?

　　15 、哪些材料可以用靜電吸附標(biāo)記?除了材料本身之外，緩沖液的電導(dǎo)率影響也很大，在電導(dǎo)率高的緩沖液中更容易標(biāo)記上。

　　16、 EDC法標(biāo)記包括一步法和兩步法，兩種方法分別具有哪些優(yōu)勢(shì)和不足?

　　17 、EDC法是利用EDC和NHS活化羧基，使其更容易與抗體偶聯(lián)，微球之間的距離比較近，其實(shí)有很大比例的抗體是通過(guò)靜電吸附到微球表面的。

　　18、 標(biāo)記過(guò)程的緩沖液有很多講究，緩沖液的電導(dǎo)率會(huì)影響抗體在微球表面的吸附，緩沖液的pH也是抗體能否標(biāo)記上的關(guān)鍵因素，且緩沖液不能影響抗體的生物活性。

　　19、 封閉步驟能夠封住微球表面除了抗體偶聯(lián)的其它地方，防止非特異性產(chǎn)生，多少封閉劑能夠盡可能多的封住，過(guò)多封閉劑是否會(huì)相互交聯(lián)而遮蔽抗體的結(jié)合位點(diǎn)?

　　20 、通常封閉劑使用酪蛋白和BSA，還有哪些物質(zhì)可以用作封閉劑且封閉效果更好?

　　21 、材料在偶聯(lián)前和偶聯(lián)過(guò)程中需要超聲，使材料分散更均勻，不同材料需要優(yōu)化超聲時(shí)間，超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)容易影響抗體偶聯(lián)效果。

　　22 、隨著標(biāo)記時(shí)間增長(zhǎng)，抗體偶聯(lián)率會(huì)逐漸增加，到一定時(shí)間后有一個(gè)飽和值，對(duì)不同材料和不同抗體的最佳的標(biāo)記時(shí)間需要摸索。

　　免疫層析

　　23 、能否通過(guò)調(diào)整樣本墊、結(jié)合墊、NC膜、吸水紙的材質(zhì)和黏貼位置，使樣本的流速盡可能的勻速以降低CV值。

　　24 、小孔徑的NC膜上樣本的流速較慢，抗原抗體具有更長(zhǎng)的結(jié)合時(shí)間，但是大粒徑的材料容易堵膜，需要換大孔徑的NC膜。

　　25、 為了使樣本具有更慢的流速，有研究設(shè)計(jì)的一種專(zhuān)門(mén)用于試紙條的離心機(jī)，通過(guò)與層析作用反向的離心力，使樣本流速更慢，也可以利用重力作用，在層析過(guò)程中將試紙條傾斜一定的角度。

　　26 、對(duì)于熒光物質(zhì)作為標(biāo)記材料，傳統(tǒng)試紙條白色的底板會(huì)有背景干擾，有研究設(shè)計(jì)了一種黑色底板，能夠消除這種背景干擾。

　　27 、環(huán)境因素對(duì)免疫層析過(guò)程具有非常大的影響，不同的溫度和濕度都可能造成結(jié)果的不可重復(fù)性。

　　28 、試紙條的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)通常是測(cè)試在不同溫度下的保存時(shí)間，濕度理應(yīng)成為考慮因素。

　　29 、有時(shí)候觀察到的堵膜現(xiàn)象，不一定是微球粒徑太大導(dǎo)致的，可能是樣本溶液的黏度較大導(dǎo)致吸水紙對(duì)其的吸引作用不夠，加入一定量的表活可以緩解。

　　30、 有時(shí)候在ELISA上抑制很好的抗體，在試紙條上的抑制很差，除了抗原抗體的結(jié)合時(shí)間不夠之外，還有什么其它原因?

　　31、 T線(xiàn)上抗原或抗體的噴量會(huì)直接影響信號(hào)值和方法的靈敏度，之間有沒(méi)有規(guī)律可循?

　　32 、通過(guò)調(diào)整C線(xiàn)上二抗的噴量，可以調(diào)整方法的靈敏度。

　　33 、檢驗(yàn)單一靶標(biāo)物時(shí)，C線(xiàn)通常噴二抗，信號(hào)值利用T/C值輸出，聯(lián)檢多個(gè)靶標(biāo)物時(shí)，C線(xiàn)可以噴其它抗體，信號(hào)值利用T值輸出。

　　34 、通常情況下靈敏度越高線(xiàn)性范圍越窄，靈敏度越低線(xiàn)性范圍越寬，這是偶然導(dǎo)致的嗎，之間有沒(méi)有什么數(shù)學(xué)聯(lián)系?

　　35、 和液質(zhì)聯(lián)用方法對(duì)比，免疫層析法通常CV會(huì)較大，尤其是靈敏度很高時(shí)CV更大，這種情況是方法本身的缺陷還是有其它的原因?

　　36、 液質(zhì)聯(lián)用通過(guò)將母離子打散成不同子離子，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)不同同分異構(gòu)體的檢測(cè)，而免疫層析法暫時(shí)無(wú)法做到檢測(cè)同分異構(gòu)體，有沒(méi)有可能能夠解決這個(gè)問(wèn)題?

　　37、 檢驗(yàn)大分子靶標(biāo)物時(shí)，濃度高導(dǎo)致的hook效應(yīng)能夠如何解決?

　　38、 抗體偶聯(lián)的標(biāo)記材料通常噴在結(jié)合墊上，隨著樣本溶液流動(dòng)，有多少能夠溶解于樣本溶液中并結(jié)合其中的靶標(biāo)物，如何提高這種比例?

　　39、 提高方法靈敏度的目的除了能夠檢測(cè)到更低濃度的靶標(biāo)物之外，在稀釋的過(guò)程中，其它雜質(zhì)的含量也在降低，從而能夠在一定程度上降低基質(zhì)干擾。

　　40、 跑條子的樣本稀釋液應(yīng)該如何選擇?通常使用PBST，PBS緩沖液是為了維持抗原抗體結(jié)合的活性，Tween是為了讓樣本溶液更好的流動(dòng)，但是經(jīng)驗(yàn)表明純水配自來(lái)水可能具有更好的效果，其中存在什么科學(xué)依據(jù)嗎?