側(cè)流免疫層析技術(shù)(LFIA)被廣泛用于黃曲霉毒素B1(AFB1)等霉菌毒素的快速檢測(cè)。然而，傳統(tǒng)的LFIA高度依賴(lài)抗原，導(dǎo)致生產(chǎn)成本高且存在健康風(fēng)險(xiǎn)。本研究開(kāi)發(fā)了一種納米抗體-堿性磷酸酶融合蛋白(AP2-5)作為AFB1分析中抗原的替代品。堿性磷酸酶(AP)在溶液中可自發(fā)組裝成二聚體，形成具有更高親和力的二價(jià)納米抗體。通過(guò)銅離子取代氧空位和單寧酸包封的方法成功合成一種新型雙模態(tài)信號(hào)示蹤劑Cu-MoOx納米顆粒(CMO)。該示蹤劑表現(xiàn)出優(yōu)異的水分散性、比色強(qiáng)度、光熱轉(zhuǎn)換效率(η = 45.58%)及抗體偶聯(lián)效率(79.10%～94.68%)。利用此CMO平臺(tái)，開(kāi)發(fā)了一種比色/光熱雙模式LFIA(CM-LFIA/PT-LFIA)，用于食品中AFB1的快速靈敏檢測(cè)。該系統(tǒng)的檢測(cè)限(LOD)低至0.0191 ng mL?¹，并在玉米、燕麥和大豆樣品中實(shí)現(xiàn)了85.07%至117.03%的回收率。

　　霉菌毒素廣泛存在于食品和飼料中，其中黃曲霉毒素 (AF)，尤其是AFB1，是毒性最強(qiáng)的霉菌毒素之一。傳統(tǒng)的AFB1檢測(cè)方法，如高效液相色譜 (HPLC)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 (HPLC-MS/MS)和四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜 (TOF/Q-TOF MS/MS)，雖然靈敏度高、準(zhǔn)確性好，但操作步驟復(fù)雜且儀器昂貴，無(wú)法滿(mǎn)足食品質(zhì)量控制中實(shí)時(shí)檢測(cè)的需求。其他一些快速靈敏的檢測(cè)方法如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定 (ELISA)、電化學(xué)傳感和CRISPR/Cas技術(shù)也已出現(xiàn)。其中，側(cè)流免疫層析法 (LFIA) 因?qū)?shí)驗(yàn)室條件依賴(lài)度低且無(wú)需專(zhuān)業(yè)知識(shí)而脫穎而出。

　　比色/光熱雙模式LFIA (CM/PT-LFIA) 因其高信號(hào)強(qiáng)度、快速響應(yīng)和強(qiáng)穩(wěn)定性具有巨大應(yīng)用前景。其成功依賴(lài)于具有強(qiáng)光熱轉(zhuǎn)換性能的材料。鉬基氧化物以其熱催化活性而聞名，例如，負(fù)載銀納米立方體的三氧化鉬 (MoO3) 納米片表現(xiàn)出改善的光熱響應(yīng)。此外，納米結(jié)構(gòu)的形貌也起著關(guān)鍵作用，對(duì)稱(chēng)性粒子如納米球和納米立方體顯示出增強(qiáng)的吸收和共振效應(yīng)，進(jìn)一步提高了光熱效率。目前用于AFB1的LFIA通常使用固定在試紙條上的抗原 (AFB1-BSA) ，這種方法成本高且對(duì)環(huán)境有害。噬菌體展示肽技術(shù)可產(chǎn)生模擬AFB1的肽，以與一抗的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合?？躬?dú)特型納米抗體的單域結(jié)構(gòu)便于進(jìn)行基因工程改造，先前研究表明，AP的二聚化特性有助于增強(qiáng)其結(jié)合納米抗體的親和力，并高效結(jié)合目標(biāo)抗原。

　　在先前的研究中，我們成功構(gòu)建了堿性磷酸酶-納米抗體融合蛋白(AP2-5)，并將其用作黃曲霉毒素衍生的替代抗原。通過(guò)一步法合成富含氧空位和單寧酸的綠色改性材料，并將其與AP2-5一起應(yīng)用于免疫分析。在免疫分析中，CMO-mAbsAFB1抗體特異性結(jié)合包被了AP2-5的檢測(cè)線(xiàn) (T線(xiàn))。當(dāng)樣品中不含游離AFB1時(shí)，由于抗體-抗原識(shí)別作用，抗體會(huì)聚集在T線(xiàn)，導(dǎo)致陰性檢測(cè)結(jié)果。隨著樣品中AFB1濃度的增加，T線(xiàn)逐漸變淺(CM模式下的定性評(píng)估)或反應(yīng)溫度降低(PT模式下的定量評(píng)估)。該免疫平臺(tái)不僅拓寬了納米抗體的應(yīng)用視野，也推動(dòng)了環(huán)保型霉菌毒素免疫傳感器的發(fā)展。

　　1.CMO的合成與表征

　　通過(guò)一步水熱法(圖 1A)，采用金屬-多酚配位策略將Mo和Cu以離子態(tài)形式引入，成功合成了CMO納米花。透射電子顯微鏡(TEM)圖像顯示，合成的CMO呈現(xiàn)出不均勻分布的復(fù)合納米結(jié)構(gòu)圖像，具有類(lèi)似花瓣?duì)畹奶卣?圖 1B)。這些納米結(jié)構(gòu)的平均直徑約為150 nm，與粒度分析儀的觀(guān)察結(jié)果一致(圖 1E)。進(jìn)一步的光譜分析證實(shí)了CMO中存在關(guān)鍵元素，包括C、O、Cu和Mo，且Cu和Mo在納米結(jié)構(gòu)中分布均勻(圖 1C)。

　　CMO的粉末X射線(xiàn)衍射圖譜(圖 1F)與四方相MoO2的標(biāo)準(zhǔn)峰(JCPDS No. 02–0422)高度吻合，但未觀(guān)察到明顯的Cu相關(guān)衍射峰。在2θ值為26.033°、37.120°和53.546°處的特征衍射峰分別對(duì)應(yīng)于(110)、(101)和(211)晶面，進(jìn)一步支持了Mo結(jié)構(gòu)的完整性。元素組成通過(guò)X射線(xiàn)光電子能譜(XPS)得到進(jìn)一步驗(yàn)證(圖 1H)，其結(jié)果與能量色散X射線(xiàn)光譜(EDS)獲得的結(jié)果一致。在Mo 3d譜中，236.2 eV和233.1 eV處的峰被確定為Mo??、Mo??和Mo??氧化態(tài)的特征峰(圖 1I)。同樣，Cu 2p?/?譜顯示主要為Cu²?和Cu?氧化態(tài)。此外，對(duì)O 1s XPS譜的深入分析(圖 1J)識(shí)別出CMO中存在大量的氧空位，這與之前的研究結(jié)果相符。

　　CMO在未經(jīng)任何修飾的情況下，對(duì)黃曲霉毒素B1單克隆抗體(mAbs)1C11表現(xiàn)出顯著的結(jié)合親和力。當(dāng)用抗AFB1單克隆抗體1C11進(jìn)行功能化修飾后，觀(guān)察到CMO的ζ-電位顯著增加，從原始值-31.1 mV變?yōu)?16.7 mV(圖 1D)。這種顯著的靜電位移表明CMO通過(guò)特異性靜電相互作用與抗體緊密結(jié)合，證實(shí)了結(jié)構(gòu)明確的CMO-mAbs探針的形成。

　　圖 1. CMO 的表征。(A) CMO 的合成流程圖;(B) 透射電子顯微鏡圖像;(C) HAADF 圖像及 EDS 元素分布圖;(D) AuNPs 和 CMO 在偶聯(lián) mAbs 前后的 Zeta 電位;(E) 粒徑分布統(tǒng)計(jì)圖;(F) 粉末 XRD 譜圖;(G) CMO 和 MoOx-NPs 的紫外吸收光譜;(H) XPS 譜圖;(I, J) CMO 在 Mo 3d 和 O 1s 區(qū)域的高分辨率 XPS 譜圖。

2.CMO光熱性能評(píng)估

　　相同濃度下收集了CMO和MoOx納米顆粒的紫外吸收光譜(圖 1G)。CMO在808 nm處表現(xiàn)出寬泛的吸收，初步表明CMO可用作LFIA的光熱轉(zhuǎn)換劑。使用近紅外激光(808 nm, 2 W cm?²)照射5分鐘，評(píng)估了不同濃度CMO的光熱轉(zhuǎn)換行為。結(jié)果表明，CMO溶液濃度(0–500 μg mL?¹)與產(chǎn)生的升溫效應(yīng)之間存在良好的正相關(guān)性，顯示出改善的光熱吸收性能(圖 2A)。如圖 2B所示，在所有濃度下，可達(dá)到的最高溫度為60.1 °C，且溫度隨時(shí)間逐漸升高并隨后趨于穩(wěn)定。此外，在300 μg mL?¹的濃度下，溫升表現(xiàn)出對(duì)激光能量密度(0.5–2 W cm?²)的明顯依賴(lài)性，在2 W cm?²下觀(guān)察到更顯著的升溫效應(yīng)(圖 2C)。

　　為了進(jìn)一步研究CMO的光熱循環(huán)行為，選擇了300 μg mL?¹的CMO以及相同濃度的MoOx納米顆粒樣品進(jìn)行測(cè)試。在四次激光開(kāi)關(guān)輻照循環(huán)過(guò)程中，CMO的最高溫度基本保持不變，表明其信號(hào)重現(xiàn)性良好(圖 2F)。最后，為了確定CMO的光熱性能，我們測(cè)量了CMO和蒸餾水的一個(gè)光熱循環(huán)，計(jì)算出其光熱轉(zhuǎn)換效率(η)約為45.58%(圖 2D)，這相比相同濃度的MoOx納米顆粒(29.72%，圖 2E)有顯著提升。

　　為了進(jìn)一步探究CMO優(yōu)異的光熱性能，我們從Cu摻雜的有無(wú)角度對(duì)其進(jìn)行了分析，并利用時(shí)域有限差分法 (FDTD)模擬了在808 nm激光照射下，CMO和MoOx-NPs在其三維空間中的電場(chǎng)分布。如圖 2H所示，MoOx-NPs的電磁熱點(diǎn)區(qū)域僅限于邊緣區(qū)域，且強(qiáng)度較低。相比之下，CMO的熱點(diǎn)密度顯著增強(qiáng)，特別是在花瓣尖端區(qū)域，該處的電場(chǎng)強(qiáng)度最大(圖2G)。這歸因于尖端對(duì)電場(chǎng)增強(qiáng)潛能的貢獻(xiàn)，這將為L(zhǎng)FIA的發(fā)展提供更具前景的示蹤劑。

　　圖 2. CMO 的光熱性能。(A) 不同濃度 CMO 的熱成像圖及 (B) 光熱升溫曲線(xiàn) (808 nm, 2.0 W cm?²);(C) 不同激光功率照射下 CMO 的光熱升溫特性 (300 μg mL?¹);(D) CMO 和 (E) MoOx-NPs 在經(jīng)歷一次 808 nm 激光開(kāi)關(guān)循環(huán)照射后的溫度曲線(xiàn)，以及冷卻時(shí)間與溫度驅(qū)動(dòng)力的負(fù)自然對(duì)數(shù)關(guān)系圖;(F) CMO 和 MoOx-NPs 在四次激光開(kāi)關(guān)輻照循環(huán) (808 nm, 2.0 W cm?²) 期間的升溫和降溫曲線(xiàn);(G) CMO 和 (H) MoOx-NPs 在 808 nm 近紅外光照射下的近電磁場(chǎng)分布圖。

　　3.免疫探針性能測(cè)定

　　Nb2-5是一種抗獨(dú)特型納米抗體，通過(guò)將抗AFB1單克隆抗體1C11注射到羊駝體內(nèi)構(gòu)建的免疫噬菌體展示納米抗體庫(kù)獲得。使用AP2-5作為包被底物測(cè)試五種不同濃度的抗體與等量CMO和AuNPs的偶聯(lián)情況。通過(guò)間接ELISA法建立了OD450 nm吸光度與抗體濃度之間的關(guān)系(圖 3B)。選擇五種濃度的抗體進(jìn)行探針?lè)跤鶕?jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)獲得上清液中剩余的抗體量，并通過(guò)公式計(jì)算抗體偶聯(lián)效率。在一致的抗體和材料濃度條件下，與AuNPs(54.57%–78.10%，圖 3D)相比，CMO與mAbs的偶聯(lián)效率(79.10%–94.68%，圖 3C)表現(xiàn)出顯著更高的性能。兩種材料的抗體偶聯(lián)效率均隨著抗體濃度的升高而呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，與AuNPs相比CMO的下降速率明顯更慢，凸顯了CMO優(yōu)異的抗體結(jié)合效率，強(qiáng)調(diào)了其作為構(gòu)建LFIA的理想納米標(biāo)記材料的選擇。

　　通過(guò)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法評(píng)估了抗原替代物(AP2-5和 Nb2-5)與抗AFB1 mAbs之間的親和力。如圖 3E 和 3F 所示，確保AP2-5和Nb2-5濃度相同的條件下，通過(guò)間接ELISA測(cè)試了吸光度與抗體濃度的曲線(xiàn)。此曲線(xiàn)用于確定抗原與抗體之間的結(jié)合親和力，表示為Ka。從圖 3G 可以看出，AP2-5的Ka值(7.80 × 10? M?¹)比Nb2-5的Ka值(1.46 × 10? M?¹)高出5倍以上。這可能歸因于AP的同源二聚體特性。抗原替代物增強(qiáng)的親和力使其在LFIA應(yīng)用中具有顯著優(yōu)勢(shì)。

圖3.CMO 與 mAbs 偶聯(lián)效果及融合蛋白性能評(píng)估。(A) CMO 和 AuNPs 與單克隆抗體偶聯(lián)過(guò)程示意圖；(B) AP2-5 的 OD450nm 值與抗 AFB1 mAbs 濃度的回歸方程；CMO (C) 和 Au NPs (D) 與 AP2-5 的偶聯(lián)效率評(píng)估（組 1–5 分別對(duì)應(yīng)抗體添加量為 5、10、15、20 和 25 μg）；Nb2-5 (E) 和 AP2-5 (F) 與單克隆抗體的親和力測(cè)定；(G) AP2-5 和 Nb2-5 的 Ka 值比較。

　　4.實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

　　為確保檢測(cè)過(guò)程的可靠性并防止假陰性結(jié)果，我們采用檢測(cè)線(xiàn) (T線(xiàn)) 強(qiáng)度和陽(yáng)性結(jié)果(8 ng mL?¹)作為主要評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)。運(yùn)行緩沖液被確定為影響探針與T線(xiàn)抗體結(jié)合的關(guān)鍵因素。經(jīng)過(guò)充分優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)在各種緩沖溶液中，PBS表現(xiàn)出最高的T線(xiàn)強(qiáng)度。CMO濃度顯著影響雙模式LFIA的性能。在0.4–1.2 mg mL?¹范圍內(nèi)，T線(xiàn)值隨著CMO濃度的增加而顯著增加。然而，過(guò)高的濃度會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果。因此，確定1 mg mL?¹ CMO為最佳濃度。孵育pH值對(duì)于探針與抗體成功偶聯(lián)至關(guān)重要。在孵育過(guò)程中添加60 μL K?CO?時(shí)獲得了最佳結(jié)果。此外，為增強(qiáng)靈敏度，研究了抗體添加體積 (3–7 μL, 1 mg mL?¹)。信號(hào)強(qiáng)度隨著抗體用量的增加而逐漸增加并趨于穩(wěn)定，最終選擇6 μL作為最佳添加體積。探針體積在檢測(cè)中也起著重要作用。T線(xiàn)顏色深度隨著探針體積的增加而加深，在15 μL(最佳體積)時(shí)達(dá)到一致的色深。免疫反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化為15分鐘，以實(shí)現(xiàn)檢測(cè)效率和特異性之間的最佳平衡。

　　5.LFIA靈敏度評(píng)估

　　根據(jù)競(jìng)爭(zhēng)性免疫分析原理，隨著AFB1濃度的增加，它會(huì)與溶液中的探針結(jié)合，導(dǎo)致結(jié)合到T線(xiàn)(AP2-5)上的探針減少。通過(guò)CM和PT兩種信號(hào)為樣品中AFB1提供更可靠的定量。在CM模式下，T線(xiàn)的灰度值隨著AFB1濃度的增加而降低(圖 4A)。其目視檢測(cè)限 (vLOD)和檢出臨界值 (COV)分別為0.8 ng mL?¹ 和 1.6 ng mL?¹，并在灰度值與AFB1濃度之間建立了標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。值得注意的是，計(jì)算得出的檢測(cè)限 (LOD)為0.0266 ng mL?¹，并且在0.04–0.2 ng mL?¹的AFB1濃度范圍內(nèi)，T線(xiàn)響應(yīng)表現(xiàn)出良好的線(xiàn)性關(guān)系，回歸方程為 y = 6474.49 − 20241.90x (R² = 0.980, 圖 4D)。

　　在PT模式下，隨著AFB1濃度的增加，T線(xiàn)的熱成像圖顏色從白色變?yōu)榧t色，表明溫度持續(xù)降低(圖 4B)。光熱反應(yīng)的vLOD和COV分別為0.4 ng mL?¹ 和 1.2 ng mL?¹。CMO優(yōu)異的光熱轉(zhuǎn)換效率使其在0.04–0.2 ng mL?¹的AFB1濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線(xiàn)性(y = 28.12 − 65.23x)，檢測(cè)限 (LOD)為0.0191 ng mL?¹，R² = 0.980(圖 4E)。與比色結(jié)果相比，光熱模式的檢測(cè)性能提高了約1.39倍。

　　此外，在理想條件下評(píng)估并優(yōu)化了AuNPs介導(dǎo)的LFIA (AuNPs-LFIA)的分析性能。AuNPs-LFIA的最佳條件包括K?CO?添加體積(2.5 μL)和抗體體積(4 μL)。圖 4C顯示了AuNPs-LFIA在0–6.66 ng mL?¹ AFB1濃度范圍內(nèi)的檢測(cè)性能，其vLOD和COV分別為1.33 ng mL?¹ 和 2.66 ng mL?¹。AuNPs-LFIA的檢測(cè)限 (LOD)為0.327 ng mL?¹。T線(xiàn)灰度強(qiáng)度在0–0.66 ng mL?¹范圍內(nèi)與AFB1濃度呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系，回歸方程為 y = 6929.78–6717.85x (R² = 0.982, 圖 4F)?；谶@些結(jié)果，CMO-LFIA對(duì)AFB1檢測(cè)的定量靈敏度顯著增強(qiáng)。具體而言，與AuNPs-LFIA相比，其靈敏度在比色模式下提高了約4.53倍，在光熱模式下提高了約6.30倍。

　　圖 4. CMO-LFIA 用于 AFB1 檢測(cè)的分析性能評(píng)估。(A) 基于 CMO 在 0–2 ng mL?¹ AFB1 濃度下的比色檢測(cè)圖像;(B) 光熱檢測(cè)圖像;(C) 基于 AuNPs 在 0–6.66 ng mL?¹ AFB1 濃度下的比色檢測(cè)圖像;(D–F) 對(duì)應(yīng)于三種檢測(cè)方法的校準(zhǔn)曲線(xiàn)。插圖：對(duì)應(yīng)于三種檢測(cè)方法的線(xiàn)性響應(yīng);(G) CMO-LFIA 在比色和光熱模式下檢測(cè) AFB1 的特異性評(píng)估;(H) 比色和光熱模式下 T 線(xiàn)的灰度值和 ΔT;(I) 使用雙模式 CMO-LFIA 免疫傳感器對(duì)燕麥片、玉米和大豆中 AFB1 的分析(數(shù)值表示為平均值，n = 3)。

　　本研究成功開(kāi)發(fā)了一種高效的CMO-LFIA用于AFB1檢測(cè)，該方法融合了由融合蛋白AP2-5介導(dǎo)的雙模態(tài)比色與光熱檢測(cè)策略。在檢測(cè)線(xiàn)(T線(xiàn))上固定二價(jià)融合蛋白AP2-5作為抗原的替代物，從而實(shí)現(xiàn)了極低的檢測(cè)限(0.0191 ng mL?¹)和優(yōu)異的回收率(85.07%–117.03%)。此外，在CMO設(shè)計(jì)中引入單寧酸包封和缺陷工程顯著提升了其性能，而納米抗體的使用則為谷物中AFB1的檢測(cè)提供了一種可持續(xù)且經(jīng)濟(jì)高效的解決方案。這種雙信號(hào)檢測(cè)策略不僅利用了兩種模式的互補(bǔ)優(yōu)勢(shì)，而且與單信號(hào)檢測(cè)相比，提供了更精確、更可靠的分析結(jié)果。